Nouvelle trousse de RT - PCR multiplex en temps réel pour le Coronavirus

Nouveau Kit RT - PCR multiplex en temps réel pour le Coronavirus (2019 ncov) (détection de 3 gènes)

Mode d'emploi

1. Utilisation prévue

Nouvelle trousse de RT - PCR multiplex en temps réel pour le Coronavirus (2019 ncov) (détection de 3 gènes) pour la détection qualitative in vitro de l'ARN du nouveau Coronavirus (2019 ncov)

Le système PCR en temps réel a été utilisé pour détecter les écouvillons nasopharyngés, les écouvillons oropharyngés et les échantillons d'expectorations. Il est considéré comme un moyen auxiliaire de diagnostiquer l'infection par le COV en 2019.

2. Principe de la RT - PCR en temps réel

Le principe de la détection en temps réel est basé sur l'analyse fluorescente de la nucléase 5 '. Au cours de la réaction PCR, l'ADN polymérase coupe la sonde à l'extrémité 5 'et isole le colorant Rapporteur.

La sonde ne peut être séparée du colorant trempé que lorsqu'elle est hybridée à l'ADN cible. La coupe provoque la production d'un signal de fluorescence par le colorant signalé coupé

Système de détection PCR. La période de PCR (CT) au cours de laquelle une augmentation du signal fluorescent a été initialement détectée est proportionnelle à la quantité de produit PCR spécifique. La surveillance en temps réel de l'intensité de fluorescence permet de détecter les produits accumulés sans rouvrir le tube de réaction après amplification.

La réaction en chaîne de la transcriptase inverse polymérase en temps réel (RT - PCR en temps réel) est utilisée lorsque la matière première est l'ARN. Dans cette méthode, l'ARN est d'abord transcrit dans l'ADN complémentaire

(adnc) transcriptase inverse à travers l'ARN total. L'adnc est ensuite utilisé comme modèle pour la PCR en temps réel.

3. Description du produit

Le coronavirus est une grande catégorie de virus, dont certains peuvent causer des maladies humaines et d'autres peuvent se propager chez des animaux comme les chameaux, les chats et les chauves - souris. Le ncov 2019 est un nouveau coronavirus. La trousse contient un système spécifique prêt à l'emploi pour la détection de l'ARN du nouveau Coronavirus (2019 ncov) par RT - PCR en temps réel. La réaction a été analysée par RT - PCR en une étape en temps réel dans un seul tube. Il comprend la transcription inverse (RT) pour la transcription de l'ARN viral en adnc et la PCR en temps réel pour l'amplification et la détection de l'adnc. La fluorescence est émise et mesurée par l'unit é optique du système en temps réel pendant la PCR. Détection de fragments d'ADN viral amplifiés

Exécuté dans les canaux fluorométriques fam, Hex / Vic et cal fluor red610 / textas Red.

4. Contenu de la trousse

Limite de détection (LOD): 200 parties / ML;

Note: Lod dépend du volume de l'échantillon, du volume d'élution, de la méthode d'extraction des acides nucléiques, etc.

Facteurs. Si la trousse d'extraction d'ARN recommandée est utilisée, la DLO est la même que celle déclarée.

Toutefois, si d'autres méthodes d'extraction sont utilisées, des vérifications supplémentaires doivent être effectuées pour assurer le rendement analytique de l'analyse.

5. Stockage

• Tous les réactifs doivent être stockés à - 20 ± 5 °C pendant 6 mois.

• l’analyse doit être utilisée dans un délai d’un mois à compter de l’ouverture.

• Le dégel et la congélation répétés (> 3x) doivent être évités car cela peut réduire la sensibilité de l’analyse.

• refroidir tous les réactifs pendant la procédure de travail.

• Le super mélange doit être stocké à l'abri de la lumière.

6. Matériaux et dispositifs supplémentaires requis

• Cabinet biologique

• mélangeur vortex

• récipients frigorifiques

• tête de filtre stérile pour pipettes miniatures

• Gants jetables sans poudre

• réfrigérateurs et congélateurs

• Système PCR en temps réel

• tube / plaque de réaction PCR en temps réel

• pipette (0,5 μl – 1000 μl)

• microtubules stériles

• conteneurs de déchets biologiques dangereux

• support de tuyauterie

• micro - centrifugeuse de type « eppendorf» (RCF jusqu'à 16 000 x G)

Mises en garde et précautions Veuillez lire attentivement ces instructions avant de commencer la procédure.

• Cette analyse doit être effectuée par du personnel qualifié.

• Les échantillons cliniques doivent être considérés comme potentiellement infectieux et préparés dans des hottes laminaires.

• Cette analyse doit être effectuée conformément aux bonnes pratiques de laboratoire.

• ne pas utiliser après expiration de la trousse.

• Évitez le dégel et la congélation répétés de l’agent exempt d’essai, car cela peut réduire la sensibilité de l’essai.

• Après dégel du réactif, le tube est séparé par vortex et centrifugation avant utilisation.

• préparer rapidement le mélange de réaction sur la glace ou dans un bloc de refroidissement.

• Mise en place d'espaces de travail séparés: 1) réglage de la réaction, 2) Séparation de l'ARN, 3)

Amplification / détection des produits amplifiés.

• Les pipettes, flacons et autres matériaux de travail ne doivent pas circuler entre les unités de travail.

• Toujours utiliser une tête d'aspiration stérile avec filtre.

• portez des manteaux et des gants individuels dans chaque zone.

• Éliminer les échantillons et les déchets d'essai conformément à la réglementation locale en matière de sécurité.

• n’utilisez pas de paille buccale. Ne mangez pas, ne buvez pas ou ne fumez pas au laboratoire.

• Évitez les aérosols

8. Prélèvement, stockage et transport des échantillons

• prélever des échantillons dans des tubes stériles;

• Les éprouvettes peuvent être extraites immédiatement ou stockées à une température comprise entre 2 °C et 8 °C pendant 24 heures ou congelées pendant une longue période à une température comprise entre - 70 °C.

• Le transport des échantillons cliniques doit être conforme

Agents pathogènes

9. Procédure

9.1 extraction de l'ARN

Différentes marques de kits d'extraction d'ARN sont disponibles. Vous pouvez utiliser votre propre système d'extraction ou

Suite commerciale basée sur la production. Pour l'extraction de l'ARN, suivre les instructions du fabricant

Instructions Les kits d'extraction recommandés sont les suivants:

Il convient de noter que les témoins négatifs et les paires positives de la trousse ont été extraits de la même façon que les échantillons.

9.2 contrôle interne

Le contrôle interne (IC) de la trousse doit être ajouté au mélange d'extraction, 1 μl par essai, afin de surveiller l'ensemble du processus.

9.3 schéma RT - PCR

Le volume du mélange principal pour chaque réaction doit être transféré comme suit:

1) volume de supermélanges et de mélanges enzymatiques par réaction multiplié par

Échantillons, y compris la quantité de référence et d'échantillon préparé. Raison:

Perfusion imprécise, toujours ajouter des échantillons virtuels supplémentaires. Mélanger complètement et tourner vers le bas

Utiliser une centrifugeuse pour un fonctionnement simple.

Transférer 20 μl de micro - Pipette du mélange principal et du filtre stérile dans chaque PCR en temps réel.

Plaque / tube de réaction. Ajouter 5 μl de gabarit (extraire l'acide nucléique des cellules négatives)

Groupe témoin, groupe témoin positif et échantillon d'essai) à différentes plaques / tubes de réaction. Fermer maintenant

Plaque / tube pour éviter la contamination.

Tourner rapidement vers le bas pour recueillir le mélange principal et le coffrage au fond du tube de réaction.

Exécuter les protocoles suivants dans l'instrument ABI prism® 7500: Bio - rad cfx96; Argot:

Si vous utilisez le système ABI prism®, sélectionnez « aucun » comme référence passive et trempette.

10. Réglage du seuil: juste au - dessus du niveau maximal du témoin négatif.

11. Contrôle de la qualité: le contrôle négatif et le contrôle positif doivent être effectués correctement; Sinon

Exemple de résultat invalide.

12. Analyse et interprétation des données

Le tableau suivant présente les résultats attendus en temps réel pour le nouveau Coronavirus (COV 2019).

Trousse RT - PCR multiple (détection de 3 gènes). Si les résultats obtenus ne sont pas conformes aux présentes lignes directrices,

Contactez liferver pour une consultation.

Note:

[A] le laboratoire doit, s'il y a lieu, faire rapport de ses résultats de diagnostic et les respecter.

Système de rapports spécifiques.

[b] le meilleur type d’échantillon et le meilleur moment pour le pic des taux de virus durant l’infection causée par le ncovh en 2019 n’ont pas été déterminés. Il peut être nécessaire de prélever plusieurs échantillons du même patient pour détecter le virus.

Si au moins deux gènes orf1ab, N et E sont positifs, l'échantillon est 2019 ncov.

Positif et optimiste Si les trois gènes sont négatifs, l'échantillon est négatif pour 2019 ncov; Si le résultat est

Le gène orf1ab ou n est positif et l'échantillon 2019 est positif pour le ncov; Si les résultats ne sont toujours positifs qu'à l'egene, l'échantillon est positif au COV 2019 ou à d'autres Coronavirus proximaux (une fois que le virus du SRAS et les échantillons non humains ont été exclus, on peut déclarer un COV 2019 positif).

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